细胞解冻和培养指南

冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后，可以立即解冻复苏，去除二甲基亚砜（DMSO）后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞，必须将细胞冻存管放置于液氮罐气相层存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低，达不到-130℃，细胞活力会迅速下降。

操作推荐

ATCC推荐在操作冻存的ATCC细胞株时使用手套，工作服和防护面具以避免任何事故发生。

检查包装，查看是否有任何破裂或渗漏。冻存的ATCC细胞株应处于固体状。

将冻存的ATCC细胞株从有干冰的包装中取出，立即复苏培养，或迅速转移放置在液氮罐气相层在-130℃以下的温度存储。

冻存细胞的复苏和培养

1、先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶，及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。（请参阅：注1）

2、小心取出装有细胞的冻存管，保持管盖拧紧，将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快，大约短于2分钟或待最后一块小冰晶体刚融化，就应将细胞冻存管取出水浴。

3、在水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂，用无菌纸巾或纱布拭干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。

4、小心拧开冻存管的顶部，将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟（125xg），小心吸去上清液以去除抗冻剂（二甲基亚砜），避免丢失细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于配好的完全培养基中。将细胞悬液转移到培养容器，轻轻摇晃使细胞均匀的分布。生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。

5、将细胞培养容器置于细胞培养箱，在温度37℃，二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。（请参阅：注2）

*注1：虽然大多数细胞株可以在一种以上的培养基中生长，但细胞的特征有可能会在更换不同培养基时发生。为保证最佳效果，请从细胞培养一开始就使用ATCC推荐指定的培养基。

*注2：某些细胞株，如杂交瘤株，可能需要几天的时间才从冻存状态下完全恢复正常生长。在细胞复苏培养第一天可能会呈现较低的细胞活力并产生一些细胞碎片。度过这一时期后，细胞会恢复并进入指数增长期。

细胞培养贴士

细胞株的生长有两种状态，贴壁细胞需要附着在一个表面进行生长（贴壁依赖性），悬浮细胞可在悬浮培养状态下生长（非贴壁依赖）。在细胞单层贴壁生长货悬浮生长中，都通常遵循四个特征性阶段：迟滞期、对数或指数期、静止或平台期及衰退期。