酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用（一）

酵母β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖，占细胞壁干质量的40％～60％。酵母β-葡聚糖是以β-1，3一葡聚糖为主，β-1，6一葡聚糖为辅的一种混合多糖，其中85％左右为水不溶性。研究表明，酵母β-葡聚糖是一种良好的生物效应应答剂，具有增强免疫力、激活免疫细胞、抗肿瘤、抗感染等功能。此外，酵母β-葡聚糖还可以抗氧化、抗辐射、降低胆固醇和血脂。因此。酵母β-葡聚糖已广泛应用于医疗、保健食品和化妆品行业中。

酵母β-葡聚糖通过分子间氢键的相互作用，形成致密的三股螺旋结构而不溶于水，水不溶性不仅制约了酵母β-葡聚糖的应用范围，也会影响其生物活性的发挥。为了提高酵母β-葡聚糖的水溶性，国内外学者对其进行了修饰和改性研究。主要方法有化学方法、物理方法和生物方法。物理方法主要有超声波法门、辐照法和机械活化法；化学方法有羧甲基化、硫酸酯化和磷酸酯化；生物方法主要是酶法。酶法增溶改性是通过β-葡聚糖酶将大分子酵母β-葡聚糖酶解成小分子葡聚糖，从而增加酵母β-葡聚糖的水溶性，水解过程条件温和，不会破坏酵母β-葡聚糖的结构，对其生物活性影响较小。目前，用于生物法对酵母葡聚糖改性增溶的酶种类少，价格昂贵。本研究中，作者在大肠杆菌中异源表达两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶，分别是β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。Gly5m来源于Saccharophagusdegradans2-40T，对于β-1，3-葡聚糖具有内切水解作用。BT3312来源于Bacteroidesthetaiotaomicron，对β-1，6-葡聚糖具有内切水解作用。通过两种不同的酵母β-葡聚糖的水解作用，可以降低酵母β-葡聚糖的相对分子质量，增加其在水中的溶解率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

E.coli(大肠杆菌)JM109：用于构建和增殖重组质粒，作者所在实验室保存；E.coli(大肠杆菌)BL21：表达宿主，作者所在实验室保存；质粒pET-28a(+)(Kan+，T7启动子)：作者所在实验室保存。

1.1.2 酶、引物、DNAmarke及相关试剂盒

PrimerSTARDNA聚合酶、DNAmarker、T4DNA连接酶和大肠杆菌感受态细胞制备盒：均购自TaKaRa(大连)；各种限制性内切酶：购自Thermo公司：PCR引物：由生工生物(上海)有限公司合成，见表1；质粒小量抽提试剂盒：购自生工生物(上海)有限公司：酵母葡聚糖：购自安琪酵母公司。

1.1.3培养基

LB培养基(组分g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5；自然pH。制备固体培养基时添加2g/dL的琼脂。

TB培养基(组分g/L)：蛋白胨12，酵母提取物24，KH₂P0₄2.31，K₂HP0₄12.54；甘油4mL。

1.2 方法

1.2.1 目的基因获得

1)gly5m的获得：根据GenBank噬菌体的gly5m基因(基因收录号：ABD82280.1)由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成。

2)bt3312的获得：根据GenBank多形拟杆菌的bt3312基因(基因收录号：AE015928.1)由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成。

1.2.2 重组载体的构连

1)pET-28a(+)-gly5m的构建：设计引物Fl和R1，以合成的gly5m为模板PCR扩增得到上游带有BamHI酶切位点和下游带有Xho酶切位点的gly5m产物。用BomHI和XhoI对PCR产物和质粒pET-28a(+)进行酶切后，用T4DNA连接酶进行过夜连接,转化E.ColiJMl09感受态,挑取转化子测序，测序正确即获得重组质粒pET-28a(+)-gly5m，见图1。

2)pET-28a(+)-bt3312的构建：设计引物F2和R2，以合成的bt3312为模板PCR扩增得到上游带有BanHI酶切位点和下游带有XhoI酶切位点的bt3312产物。用BamHI和XhoI对PCR产物和质粒pET-28a(+)进行酶切后，用T4DNA连接酶进行过夜连接，转化E.coliJMl09感受态细胞，挑取转化子测序，测序正确即获得重组质粒pET-28a(+)-bt3312。

1.2.3 重组载体的转化与诱导表达

挑取测序正确的重组质粒转化E.ColiBL21(DE3)。挑取单菌落接种于装有3mLLB液体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素)的12mL摇菌管中，37℃、220r/min过夜培养。种子液按2％接种体积分数转接至含50mLTB(含有50μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素)的250mL三角瓶中，37℃、220r/min培养至OD60=0.6～0.8，添加终浓度为0.2mmol/L的IPTC诱导，诱导表达12h，收集菌体。

1.2.4 重组β-葡聚糖水解酶的酶活测定

发酵液于7000r/min离心10min，分离得到上清液即胞外粗酶液。收集菌体，用质量分数0.9％的生理盐水洗涤，20mm01/LPBS缓冲液(pH7.5)重悬菌体，稀释至合适的浓度，超声破碎。13000r/min离心30min，分离得到破碎上清液，即胞内粗酶液。底物配制：20mmol/LPBS缓冲液(pH7.5)，10mg/mL的酵母葡聚糖。990μL底物加10μL适当稀释的粗酶液于37℃水浴保温30min，DNS法测还原糖质量浓度。

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