酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用（二）

1.2.5 重组β-葡聚糖水解酶水解产物HPLC分析

水解条件：20mmol/LPBS缓冲液(pH7.5)，酵母葡聚糖4g/L，酶活10U/mL。设置3个实验组：第一组只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二组只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三组同时添加等酶活的β-l，3-葡聚糖水解酶Glv5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃下反应12h，取样分析。水解样品使用孔径0.22μL的滤膜过滤后，采用高效体积排阻色谱和多角度激光散射联用进行相对分子质量测定。采用Ultmhydrogel删色谱柱(300mm×7.8mm，美国沃特斯公司)、多角度激光散射检测器(美国怀雅特公司)检测和示差折光检测器(美国怀雅特公司)检测。条件：0.1mol/LNaN03溶液作为流动相，流速恒定保持在0.6mL/min，柱温保持在40℃，进样量为10μL。

1.2.6 重组β-葡聚糖水解酶产物溶解率测定

水解条件：20mmol/LPBS缓冲液(pH7.5)，酵母葡聚糖25g/L，酶活200U/mL。设置3个实验组：第一组只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二组只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三组同时添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃反应12h，定时取样。样品于12000r/min离心10min，用蒽酮法测定上清液中的总糖质量浓度。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增和重组载体的构建

2.1.1 pET-28a(+)-gly5m的构建

以合成的gly5m为模板，引物F1和R1进行PCR扩增，扩增得到大约2700bp的片段，见图2(a)。

采用DNA纯化回收试剂盒对单一凝胶片段进行回收，回收后的gly5m片段与用BamHI和XhoI酶切后得到的线性质粒pET-28a(+)-gly5m连接，转化E.ColiJMl09，挑取转化子交由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果正确，重组载体pET-28a(+)-gly5m构建成功。

2.1.2 pET-28a(+)-bt3312的构建

以合成的bt3312为模板,引物F2和R2进行PCR扩增，扩增得到大约1600bp的片段，见图2(b)。采用DNA纯化回收试剂盒对单一凝胶片段进行回收，回收后的bt33122片段与用BamHI和XhoI酶切后得到的线性质粒pET-28a(+)-6bt3312连接，转化E.ColiJMl09，挑取转化子交由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果正确，重组载体pET-28a(+)-bt3312构建成功。

2.2 诱导温度对重组β-葡聚糖水解酶的影响

2.2.1 诱导温度对Gly5m的影响

将重组菌EcoliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分另0在20、25、30℃下诱导12h，离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图3(a)。重组菌分别在20、25、30℃下诱导12h后，所得重组β-葡聚糖水解酶Glv5m总酶活分别为605、707、559U/mL。结果表明，温度对重组β-葡聚糖水解酶Gly5m的酶活影响较小。另外,重组菌在30℃诱导12h后，Glv5m都分泌到胞外，细胞破碎上清液无酶活；在20、25℃诱导12h后，细胞破碎上清液中还存在少量重组β-葡聚糖水解酶。

2.2.2 诱导温度对BT3312的影响

将重组菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分别在20、25、30℃下诱导12h后，离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图3(b)。重组菌在30、25、20℃下诱导12h后，所得重组β-葡聚糖水解酶BT3312总酶活分别为l652、1896、1888U/mL，25℃诱导时酶活最高。另外，重组菌在20℃诱导时，BT3312胞内酶活最高。结果表明，温度不仅影响BT3312的酶活，同时也会影响BT3312向胞外分泌。

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