酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用（三）

2.3 诱导时间对重组β-葡聚糖水解酶的影响

2.3.1 诱导时间对Gly5m的影响

由2.2.1可知，重组蕃E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-gly5m在25℃诱导时酶活最高，故将重组菌在25℃分别诱导4、6、8、10h。离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图4（a）。重组菌在25℃诱导4h后，重组β-葡聚糖水解酶Gly5m总酶活达到最高，为1086U/mL，且此时胞外酶活也达到最高，为888U/mL。此外，重组菌在诱导时间超过4h后，总酶活开始下降，说明Glv5m不稳定，开始降解。

2.3.2 诱导时间对BT3312的影响

由2.2.2可知，重组菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-bt3312在25℃诱导时酶活最高，故将重组菌在25℃分别诱导4、6、8、10h。离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图4(b)。重组菌在30℃诱导8h后，总酶活达到最高，为2355U/mL,且此时胞内、胞外酶活均达到最高,分别为917、1438U/mL。此外，重组菌在诱导时间超过8h后，酶活开始下降，说明BT3312也不稳定。

2.4 重组β-葡聚糖水解酶的水解产物HPLC分析

以未经重组β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖为对照，对3个实验组水解产物进行HPLC分析，结果见图5。两种重组酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且两种重组酶可以同时添加共同发挥作用。比较3种水解方式所得产物发现，经BT3312水解后，所得产物相对分子质量最大，推测原因可能是BT3312专一性水解β-1，6-糖苷键，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10％～15％，因此通过BT3312水解后，所得产物中大部分的β-葡聚糖没有水解，故相对分子质量大。反之，Glv5m主要水解β-l，3-糖苷键，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故经Glv5m水解后，所得产物相对分子质量更小。此外，当BT3312和Glv5m共同水解时，水解最彻底，剩余的底物最少，推测原因是酵母β-葡聚糖中同时含有β-l，3-糖苷键和β-1，6-糖苷键，而β-l，6-糖苷键的存在可能会影响β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m发挥作用，故当β-l，6-葡聚糖水解酶BT3312水解掉β-1，6-糖苷键后，Gly5m才能更好地发挥水解作用，使水解更加彻底。

2.5 重组β-葡聚糖水解酶水解产物的溶解率

酵母β-葡聚糖经过Gly5m和BT3312单独或共同水解后，溶解率均有增加，结果见图6。添加相同酶量水解时，同时添加Glv5m和BT3312，水解产物溶解率增加量最多，从12％增加到50％，水溶性酵母葡聚糖质量浓度为12.5g/L。当Gly5m和BT3312共同水解时，酵母葡聚糖水解最彻底，前后结果一致。当只用Glv5m水解时，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6倍，水溶性酵母葡聚糖质量浓度为11g/L；当只用BT3312水解时，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4倍。水溶性酵母葡聚糖质量浓度为10.25g/L。

3 结语

酵母β-葡聚糖广泛应用于医疗、保健食品和化妆品行业中，但因为其水不溶性，限制了它的应用。作者在E.coli中表达了两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶，两种酶不仅都有水解酵母β-葡聚糖的能力，而且可以同时发挥作用。通过两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且结构和活性不被破坏。但是，两种水解酶在E.coli中表达量低,SDS-PAGE检测分析中没有明显条带，为进一步提高表达量和酶活，可通过优化培养基、培养条件、构建不同启动子的表达系统等进行尝试表达。此外，作者对两种酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只进行了初步探索，为进一步提高水解效率，可以优化水解条件、添加的酶活浓度以及两种水解酶的比例。

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