基于HPLC指纹图谱结合化学模式识别的黄蛭益肾胶囊质量控制（一）

目的 建立黄蛭益肾胶囊HPLC指纹图谱，采用指纹图谱并结合化学模式识别技术对黄蛭益肾胶囊进行质量控制。方法 采用Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长210 nm。采用HPLC串联四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS/MS）对共有峰定性分析，采用聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）统计分析。结果 16批样品中共标定24个共有峰，相似度评价均大于0.9，鉴定了其中24个峰并归属于7味药；HCA及PCA识别方法将样品分为3类；PLS-DA筛选出包括黄芪异黄烷苷、人参皂苷Rg1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、绿原酸在内的8种主要差异成分。结论 建立的HPLC指纹图谱可最大程度反映黄蛭益肾胶囊的药味组成信息，较全面反映其质量，应用的评价分析技术可合理评价其质量差异并准确寻找出差异成分，为其质量合理控制和标准完善提供依据。

黄蛭益肾胶囊由黄芪、水蛭、枸杞子、牛膝、车前子、山药、薏苡仁、玄参、墨旱莲、杜仲、三七、益母草、北沙参、蝉蜕、紫河车15味药材组成，根据著名肾病学家邹云翔教授独创的经验方精制而成，功效补气养阴、健脾益肾、化瘀利水，用于轻、中度慢性原发性普通型肾炎的气阴两虚或兼有血瘀，水湿证者。黄蛭益肾胶囊药味众多，性质各异，化学成分复杂，该制剂目前的研究主要在临床应用方面，缺乏对其质量控制方面的研究。现行质量标准内容简单，质量控制不全面，方法也较为落后，定量指标单一，不能表征黄蛭益肾胶囊的整体化学组成，难以对药品进行全面的质量控制，这样势必影响临床用药的有效性。

中药指纹图谱的特点包括整体性、特征性及可量化等方面，突出中药的完整面貌，在研究中药有效成分、控制中药质量以及鉴别方面的作用越来越突出。化学模式识别技术可将指纹图谱信息数量化，客观反映中药质量信息，包括聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）、判别分析（DA）和人工神经网络技术（ANN）等，是一种有效评价中药质量的方法。中药指纹图谱结合化学模式识别，是中药真伪鉴别、质量评价的有力手段，已经广泛应用于中药材及制剂的质量控制方面。本研究首次采用HPLC建立黄蛭益肾胶囊的指纹图谱，应用HPLC-Q-TOF-MS/MS对其共有成分进行定性分析，并结合HCA、PCA、和PLS-DA对其进行质量评价并发现造成不同批次间质量差异的因素，为黄蛭益肾胶囊质量控制和完善质量标准奠定基础。

1 材料

高效液相色谱仪Ulti Mate3000（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Bruker四级杆飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）；XSE105型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo Heraeus Multifuge X3离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；KUDOS超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q®型超纯水仪（美国密理博公司）。

对照品：松脂醇二葡萄糖苷（批号111537-20160501，质量分数≥91.7%），购自中国食品药品检定研究院；7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷（批号Y28M10H84303，质量分数≥98%）、黄芪异黄烷苷（批号Y08S8H43409，质量分数≥98%）、美迪紫檀苷（批号P21N9F75533，质量分数≥98%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号Y27F9H54731，质量分数≥98%）、芒柄花苷（批号R28O8F46957，质量分数≥98%）、毛蕊异黄酮（批号Y24N9Y75652，质量分数≥98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；芒柄花黄素（批号MUST-18033005，质量分数≥99.03%），购自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

黄蛭益肾胶囊16批样品、处方中每味药的原药材（经苏州市药品检验检测研究中心闵春艳主任中药师鉴定合格）、缺单味药的黄蛭益肾胶囊阴性样品均由苏州雷允上药业有限公司提供。16批样品编号S1～S16，相应批号分别为OC26002、PC26002、QC26001、RC26003、RC26004、RC26005、RC26006、RC26007、RC26008、RC26009、RC26010、RC26011、SC26001、SC26005、SC26006、SC26007。

2 方法

2.1 色谱条件

以Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A)-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脱程序：0～5 min、5%A,5～85 min、5%～45%A；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；进样体积10μL；检测波长210 nm。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子扫描模式，扫描范围m/z 50～1 500，干燥气温度180℃，干燥器体积流量6 L/min，雾化器压力150 k Pa，毛细管电压4.5 k V，裂解电压500 V，碰撞能量35.0 e V。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备

精密称定本品粉末约2 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 m L，超声处理（功率100 W，频率52 k Hz)30 min，取出，放冷，上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备

取松脂醇二葡萄糖苷、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷、黄芪异黄烷苷、美迪紫檀苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为18.00、8.40、21.20、8.40、20.08、15.94、29.28、16.92 mg/L的混合对照品溶液。

2.3.3 药材溶液的制备

取黄芪、水蛭、枸杞子、牛膝、车前子、山药、薏苡仁、玄参、墨旱莲、杜仲、三七、益母草、北沙参、蝉蜕、紫河车各2 g，同“2.3.1”项下方法制备成单味药供试品溶液。

2.3.4 缺单味药的阴性样品溶液的制备

分别取缺单味药的阴性样品2 g，同“2.3.1”项下方法制备成阴性样品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

按“2.3.1”项下方法制得供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定。以16号峰毛蕊异黄酮为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD<0.38%、3.97%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

按“2.3.1”项下方法制得供试品溶液（S1)6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以16号峰毛蕊异黄酮为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD<0.24%、4.35%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

按“2.3.1”项下方法制得供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件，分别在0、3、6、12、18、24 h进样测定。以毛蕊异黄酮为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD<0.24%、4.57%，表明样品在24 h内稳定。

2.4.4 耐用性试验

取同一批样品溶液（S1），分别选取同一色谱柱Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）的不同批号进样，批号分别为0135383132、0136392001、0137392827，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以毛蕊异黄酮为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD<0.39%、6.94%。

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