展青霉素检测

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册

      展青霉素(Patulin)是由荨麻青霉(Penicillium uiticae Bainier)、扩展青霉(P．expansum Link)和棒曲霉(AFper gillus clavatus Des-mazieres)等霉菌代谢产生的。它主要存在于霉烂的水果及制品中。该毒素是一种神经毒，具有致癌和致畸性。

     展青霉素为无色结晶，熔点为110℃，结构式见图22—1。展青霉素溶于水和乙醇。在碱性溶液中不稳定并可丧失其生物活性，在酸性溶液中较稳定，耐热。

     日本曾发生奶牛的展青霉素中毒，出现上行性神经麻痹，中枢神经系统水肿及灶状出血。但动物实验并不一定引起神经系统的损害。小鼠静脉注射的LD50，为25～35mg/kg，注射后出现皮下组织水肿，腹腔及胸腔积液，肾淤血及变性，明显肺水肿，呼吸困难，尿量减少。注射处出现水肿、炎症，随后组织坏死。人摄入后可引起呕吐和胃刺激症状。1％展青霉素油膏能引起人皮肤过敏。它能诱发实验动物肿瘤，使小鼠细胞及枯草杆菌发生突变反应。  

      从70年代起，国外对水果制品中展青霉素的污染调查进行了大量的工作。美国、丹麦等国家制定了推荐性卫生标准。展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。我国建立了双向薄层扫描定量测定法。

一、薄层色谱法    

     本方法为苹果汁中展青霉素的薄层色谱分析方法，为A．O．A．C方法。

    (一)原理     用乙酸乙酯提取苹果汁，然后将抽提液在硅胶柱上净化。浓缩后经薄层色谱分离，用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(3-methyl-2-benzothia—zolinone hydrazone，MBTH)盐酸溶液喷显，在波长360nm紫外光下，展青霉素呈黄棕色荧光斑点，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定含量。  

  (二)仪器和试剂    

1、小型粉碎机；  

 2、电动振荡器；  

3、薄层色谱分析所需仪器：玻璃板20cm×20cm；涂布器；固定盘；微量注射器(10μL)；展开槽；360nm紫外灯；喷洒瓶；

 4、硅胶：柱层析用：E．Merk硅胶60，O.063～0.2mm；薄层用E．Merk硅胶G；(或相当产品)    

5、展青霉素标准溶液：称取0.500mg展青霉素标准品，溶于三氯甲烷中，使其浓度为10μg/mL，0℃避光保存，用时避光升至室温；    

6、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸(MBTH·HCI)溶液：把0.5g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙水合盐酸盐(MBTH·HCl·H20)溶于100mL水中，4℃保存，每三天制备一次；

 7、无水硫酸钠；  

8、苯、乙酸乙酯均重蒸后使用。  

(三)样品的提取  

       将50mL样品放入250mL分液漏斗中，用3份50mL乙酸乙酯剧烈提取三次，将上层提取液合并；并用20g无水硫酸钠干燥约30min；用玻璃棒将开始形成的团块捣碎，将上清液转入250mL有刻度的烧杯中；用2份25mL乙酸乙酯洗涤硫酸钠，并加到提取液中。在蒸汽浴上用缓慢的氮气流蒸发至25mL以下(不要蒸干)。冷却至室温。如需要，可用乙酸乙酯调整体积至25mL，并用苯稀释至100mL。  

(四)纯化方法  

    在装有约10mL苯的色谱管的底部放一团玻璃棉并弄实，加15g用苯调制的硅胶浆。用苯洗