新型冠状病毒检测试剂质量把控要点（一）

引言

2019年12月以来，湖北省武汉市出现新型冠状病毒肺炎疫情，随疫情蔓延，我国其他地区及境外多个国家也相继发现此类病例。该病作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为COVID-19，国际病毒分类学委员会的冠状病毒研究小组建议把新型冠状病毒命名为SARS-Co V-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒）。新型冠状病毒属于b属的冠状病毒，基因组为线性的单股正链RNA，是已知可感染人类的第7种冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。可引起人类呼吸道感染，其基因特征与严重急性呼吸综合征（SARS）相关冠状病毒和中东呼吸综合征(MERS)相关冠状病毒有明显区别，基因组序列约由29 kb碱基对构成，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白。此次由SARS-Co V-2引起COVID-19疫情具有传染性强、传播迅速等特点，对该病毒进行快速、准确的实验室检测有利于有效控制疫情发展及对病患的及时诊治。疫情爆发以来，由于时间紧迫，研发任务紧急，已上市的产品存在质量上的不足。为提升试剂产品的性能，以便其更好地在疫情防控中发挥作用，本研究结合注册检验过程中发现的问题，从检验角度着重分析可能影响产品性能和质量的把控要点，并提出相关建议，为今后SARS-Co V-2实验室检测试剂的研发工作提供参考与思路。

1 新型冠状病毒肺炎的实验室检测方法

目前，针对新型冠状病毒肺炎的实验室检测方法主要分为病原学方法及血清学方法。病原学检测主要为核酸检测法，检测原理是检测患者体液样品中SARS-Co V-2特异性RNA序列。目前上市的核酸检测试剂均采用新型冠状病毒基因组中ORF1ab、E蛋白和N蛋白进行选择。不同产品的检测原理基本一致，主要区别在于其设计的引物和探针，二重检测的靶基因主要是双靶区段（ORF1ab、N基因）、三重检测的靶基因主要是三靶区段（ORF1ab、N基因和E基因）。核酸检测方法包括基因测序法、实时荧光定量PCR法、微滴式数字PCR法和恒温扩增芯片法等技术。最常用的是实时荧光PCR法，具有高特异性、高灵敏度的特点，是一种快速、成本较低且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。对实验室人员的操作能力、仪器设备要求较高。

血清学方法检测原理基于免疫学抗体检测，是检测新型冠状病毒进入人体后所产生的特异性抗体。方法包括：免疫层析法、酶联免疫吸法及化学发光免疫分析法等。已上市的抗体检测试剂主要针对检测抗体Ig M、抗体Ig G及总抗体。抗体Ig M是机体受到病原体的攻击后人体初次体液免疫应答出现的抗体，是最先产生并迅速到达峰值的抗体，可用于早期诊断。抗体Ig G产生较晚，但在血清中浓度较高、亲和力水平高，存在时间久，即使患者恢复后其浓度仍可保持较高水平，可被用于提示感染处于中后期或既往感染。与核酸检测相比，病毒抗体检测对临床实验室的操作要求相对要低，而且抗体血清学检测的样本来源于外周血、血清或血浆，具有良好的稳定性，从而可以提高检测的敏感度。且血液样本更易获得，采集操作简单快速，降低了医护人员在样本采集和检测过程中被感染的概率。抗体检测具有速度快、通量高的特点，更易于在基层实验室进行。但在人群流行率总体很低的情况下，病毒抗体检测不适用于大面积复工、复产、复学等普通人群的筛查工作，也不适用于在低流行地区进行流行病学的调查。

核酸检测病毒的RNA，是病毒存在的直接证据，而机体感染病毒后产生体液免疫应答，产生的抗体就是病毒存在间接证据，可以判断患者是否近期或既往感染过2019新型冠状病毒。国家卫生健康委员会（卫健委）组织专家制定前六版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中都以病原学方法，如实时荧光RT-PCR检测和病毒基因测序作为诊断标准。而在2020年3月3日卫健委发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》（以下简称《诊疗方案第七版》）中明确指出诊断标准在原有病原学方法基础上，又增加“血清学检查”作为诊断新型冠状病毒肺炎判定的依据，即“血清新型冠状病毒特异性Ig M抗体和Ig G抗体阳性”或“血清新型冠状病毒特异性Ig G抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍以及以上升高”也可确诊。《诊疗方案第七版》中也增加疑似病例排除标准，即疑似病例排除必须满连续两次新型冠状病毒核酸检测阴性（采样时间至少间隔24 h），且发病7 d后的新型冠状病毒特异性抗体Ig M和Ig G仍然阴性。病毒核酸检测仍然是新型冠状病毒肺炎确诊感染的“金标准”，而抗体检测可以作为病毒核酸检测的有效补充。

2 2019新型冠状病毒检测试剂盒上市情况

截至2020年7月16日，已有44个新型冠状病毒检测试剂盒经国家药监局审批上市，均为定性检测试剂。基于病原学检查的新型冠状病毒（2019-n Co V）核酸检测试剂盒共计23个，其中16个荧光PCR法试剂、1个联合探针锚定聚合测序法试剂、1个恒温扩增芯片法试剂、1个杂交捕获免疫荧光法试剂、1个恒温扩增-实时荧光法试剂、1个RNA捕获探针法试剂、1个RNA恒温扩增-金探针层析法试剂及1个双扩增法试剂。新型冠状病毒（2019-n Co V）抗体检测试剂盒共计21个，其中包括8个免疫层析试剂、11个化学发光法试剂、1个量子点荧光免疫法试剂、1个酶联免疫法试剂。

3 2019新型冠状病毒检测试剂盒产品性能质量控制要点

2 0 2 0年2月8日，科技部发布《科技部关于发布新型冠状病毒(2019-n Co V)现场快速检测产品研发应急项目申报指南》（后简称《申报指南》），面向社会征集更加快速、便捷、准确的新型冠状病毒的现场快速检测产品。企业纷纷响应国家政策号召，积极参与到SARS-Co V-2检测试剂的研发生产活动中来。但由于SARS-Co V-2是新发病毒，故在研发生产过程中存在诸多难题，如：时间紧迫、相关技术把控要点掌握不到位以及较难获得足够量的临床样本等。2020年2月12日，医疗器械技术审评中心发布了《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点（试行）》（简称《核酸审评要点》），并在13 d后发布了《2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点（试行）》（简称《抗体审评要点》）。依据《审评要点》及其他已发布的相同方法学相关行业标准，结合检验过程中发现的问题，建议企业对研发过程中可能影响产品性能和质量的要点应予重点关注，如：阳性判断值确定、最低检测限确定与验证、交叉反应、精密度检测方法、企业参考品的设置与制备、不同样本类型的核酸提取方法/试剂验证、内源/外源物质干扰验证及血液样本灭活方式等。

3.1 核酸检测试剂性能质量控制要点

3.1.1 阳性判断值确定资料

由于目前该类试剂盒没有计量学溯源性，所以确定资料主要是指对申报产品病毒核酸检测的Ct值（结果判断的临界值）进行确认的资料。资料中样本来源应考虑尽可能多的因素，并选取具有代表性的样本。对所选择阳性判断值研究方法的合理性，灰区建立的基础、阈值设置的科学合理性进行阐述和验证。

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