新型冠状病毒检测试剂质量把控要点（二）

3.1.2 最低检测限的确定及验证

最低检测限的确定及验证是评价产品性能的重要环节。因目前新型冠状病毒核酸检测试剂国家参考品均无量值定值，故企业在研发过程中无法通过国家参考品进行量值溯源，这就需要企业对最低检测限进行合理设定及验证。在进行最低检测限的确定时，应至少包含不同来源的三个具有代表性的2019新型冠状病毒的真实临床样本或含有该病毒RNA片段的假病毒颗粒，用适当基质进行系列梯度稀释，在最低检测限浓度水平进行验证，结果应达到90%～95%阳性检出率。采用科学的方法标定病毒滴度，进行最低检测限相关的量值研究，并且提供详细的病毒液滴度的验证结果。

3.1.3 交叉反应验证

交叉反应实验可以直接反应出试剂特异性方面的性能，特异性高的试剂可以减少假阳性样本的出现。试剂需在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。《核酸审评要点》中列举了约50余种病毒和细菌种类，企业如无法获得全部种类的样本，建议至少在冠状病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7个大类别中分别挑选代表病毒或细菌样本进行验证。其中对于难以获得真实样本的类型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等相关资料。

3.1.4 精密度检测方法

《核酸审评要点》中要求精密度性能验证需要多个临床样本，除模拟样本外，同时应包含若干临床样本，至少包含阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品。精密度评价试验及注册检验过程中应包含核酸分离/纯化步骤。重复性参考品中应包括高、低两个浓度的样本，其中低浓度应为最低检出限附近的浓度。

3.1.5 企业参考品的设置与制备

2020年4月16日，中国食品药品检定研究院标准物质和标准化管理中心发布了《注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录（第八期）》，目录中增加了6个新型冠状病毒抗体、抗原及核酸检测试剂相关的国家参考品，此批应急用国家参考品可用于评估各申报试剂的性能，但没有公布量值及计量溯源。

各企业应根据产品性能的实际情况，同时参照中国食品药品检定研究院的新型冠状病毒核酸检测试剂国家参考品设置企业内部参考品的项目及内容，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、重复性参考品，且应不低于国家参考品要求。其中，阳性参考品应至少选取不同来源、不同滴度水平的5个病毒样本。阴性参考品则主要包含对交叉反应进行验证的样本。检测限参考品的浓度水平可等于或略高于最低检测限的水平。企业应对内部参考品的来源、型别鉴定、病毒滴度等信息进行精确的试验验证，并提交详细的方法、使用试剂、具体数据结果等验证资料。除SARS冠状病毒、MERS冠状病毒可采用假病毒外，参考品应均为临床真实样本。

3.1.6 不同样本类型的核酸提取方法/试剂验证

目前有多种样本类型，拭子材质、采集方法、样本采集量和采样时机等都与病毒载量密切相关，可直接影响到试剂的检出率。《诊疗方案第七版》中，明确病原学检查样本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、粪便等标本[1]。《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中将标本采集种类做了进一步的细化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本、眼结膜拭子及便标本，并对不同类型的样本分别有相应的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组发布了《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测》中，规定原则上不超过5个的咽拭子进行充分混合，形成混合待检样本。面对种类众多的样本类型，且包括混合样品，这就需要企业对于上述所有样本类型的核酸提取试剂/方法的提取效率、提取纯度等，有针对性地对样本的灭活/液化、加样体积和模板洗脱体积做研究验证，明确说明具体操作过程，并提供详细的验证资料。若提取过程中涉及配套使用的自动核酸提取仪，企业还需要提供核酸提取仪的相关注册证书、仪器使用说明书及配套提取试剂盒的使用说明书。从而确保检测体系具有可控性，提高试剂灵敏度，降低假阴性结果的出现，保证检测过程顺利进行。

3.2 抗体检测试剂性能质量控制要点

抗体检测质量控制要点与核酸检测基本一致，但考虑抗体检验容易受到样本溶血、纤维蛋白、细菌污染或患者自身抗体等因素的影响，容易造成假阳性。因此，内源/外源物质干扰验证及血液样本灭活方式对试剂的影响也需要企业进行合理验证。据薛雄燕等[7]报道，采用荧光免疫分析法检测SARS-Co V-Ig M，灭活前结果为阴性的标本，灭活处理后所有检测结果均为阳性，阴性符合率为0，表明此方法不可采用56℃、30min灭活处理后的样本进行检测。说明不同的灭活方法会影响抗体检测结果，企业应在试剂说明书中写明样本灭活方法，并加以验证。对于同时可检测Ig M、Ig G两种抗体的检测试剂盒，企业阳性参考品制备时要注意合理均匀分配两种抗体阳性样本的比例，且应包含有Ig M、Ig G两种抗体阳性的样本，也包含有Ig M、Ig G单独抗体阳性的样本。

4 建议

2019新型冠状病毒肺炎疫情的突发是对企业的研发能力、生产能力的一场巨大考验，也是对临床实验室的检测能力、安全防范的一次极大挑战。疫情在全球范围内蔓延造成了对SARS-Co V-2检测试剂的巨大需求，研发生产出更加快速、便捷、准确的SARS-Co V-2检测试剂成为各个厂家研发的目标。疫情初期，对实验室检测结果出现假阳性、假阴性的质疑声不绝于耳，但检测过程中的各个环节都会影响检测结果的准确度，如：试剂质量、采用方式、样品质量、操作人员、仪器性能等。应急研发生产的试剂在质量方面可能存在差异，仍有待进一步进行验证及比对。但各个检测实验室应根据自身具体情况，制定建立完整、合理和科学的技术操作规程、生物安全防护管理制度、结果质量保证措施及结果报告的规范等，同时应对检测人员进行严格的培训与考核。各个检测实验室应针对不同仪器、人员、方法和试剂开展室间质评实验比对活动，确保最终结果的准确性和可靠性，以便更好地指导临床诊疗工作。在注册检验及审批过程中应加强质量把控，保证检验质量，提高检验效率，确保检验结果的准确可靠，从而确保上市产品的质量。随着技术的发展与研究的深入，病毒检测技术与方法日趋成熟完善，SARS-Co V-2检测试剂会更好地服务于临床，为做好常态化疫情防控工作提供强有力技术支撑。

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