抗新型冠状病毒候选药物法维拉韦首批国家对照品的研制（四）

2.2.5 炽灼残渣

按《中国药典》2020年版四部通则0841炽灼残渣检查法，取待标品约1 g，精密称定，置铂坩埚中于700 ℃下炽灼至恒重，计算残渣量为0。

2.3 含量测定

2.3.1 质量平衡法

根据水分、残留溶剂、炽灼残渣及HPLC纯度的测定结果，按质量平衡法计算，本批对照品的含量＝（1-水分-残留溶剂-炽灼残渣）×HPLC纯度＝（1-0.15％-0.12％-0）×100％＝99.73％，修约为99.7％。

2.3.2 氟核磁共振定量法

采用氟核磁共振定量法对质量平衡法赋值结果进行验证，采用zgig脉冲序列在恒温25 ℃下获取19F核磁共振谱，见图8，谱宽δ 60，射频中心频率δ -100，采样点数131 072，采样时间1.91 s，弛豫时间30 s，采样次数16，空扫次数4，增益101。分别精密称取法维拉韦约20 mg与内标物质4,4’-二氟二苯甲酮约10 mg，置同一离心管中，加2 mL氘代二甲基亚砜溶解，取约0.7 mL溶液转入5 mm核磁管中测定。平行配制3份样品溶液，采用δ -92.8处样品信号和δ -106.5处内标响应信号，以核磁共振定量法计算法维拉韦含量为99.0%（n=3，相对标准偏差（RSD）= 0.92%）。

2.3.3 进口对照品外标法

采用HPLC法测定，色谱柱为ACE Excel C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 µm），柱温40℃，流动相为磷酸二氢钾缓冲液（pH 2.5）-乙腈（93:7），流速1.0 mL/min，检测波长322 nm。待标品和对照品溶液的质量浓度均为0.2 mg/mL，按外标法计算，以法维拉韦TLC进口对照品作为对照，本批对照品含量为100.7％。

2.3.4 差示扫描量热法

称取法维拉韦待标品约3 mg，置40 μL标准铝坩埚中测定分析。温度范围175~205 ℃，升温速率为0.5 ℃/min，气氛氮气体积流量为50 mL/min。结果见图9，待标品的起始熔点为189.0 ℃，DSC纯度为99.8％，测试结束后待标品粉末变黑，可能熔融分解，该项纯度结果仅供参考。

2.4 均匀性和稳定性考察

2.4.1 均匀性考察

法维拉韦待标品分装后，随机抽取12支，每支独立测定2次，称样量为20 mg，质量浓度为0.2 mg/mL。按“2.3.3”项色谱条件采用HPLC法测定，按照随机序列表进样，以峰面积/称样量为Y轴，瓶号为X轴，进行单因子方差分析，P＝0.27>0.05，结果表明该批待标品瓶间瓶内均匀性良好。

2.4.2 稳定性考察

将分装后的法维拉韦待标品置于40 ℃、RH 75%恒温恒湿箱中，考察本品在极端运输条件下10 d内的稳定性，依次在第0、5、10天分别取样2瓶，监测HPLC纯度变化情况。第0、5、10天的测定结果均未检出杂质，HPLC纯度为100%，法维拉韦主峰响应值一致，表明该批待标品在极端运输条件下10 d内稳定性良好，可以常温条件运输。

3 讨论

法维拉韦首批国家对照品研制中，采用了质量平衡法、氟核磁共振定量法、进口对照品外标法以及差示扫描量热法4种不同原理的含量测定方法测定了对照品的含量，结果分别为99.7%、99.0%、100.7%、99.8%。由于质量平衡法是WHO推荐的药品标准物质定值方法，能够更准确地反映本品的真实含量，因此该批对照品以质量平衡法的结果进行赋值。研制得到的法维拉韦首批国家对照品具备纯度高、量值准确、稳定性好的特性。

氟核磁共振谱图一般较宽，发生样品响应信号与内标信号重叠或干扰的可能性较小，内标选择比氢核磁共振定量试验的限制更少。但较宽的图谱容易导致基线不平，相位较差。为了消除这些影响，本试验将射频中心频率设定为δ -100.0，位于样品信号（δ -92.8）与内标信号（δ -106.5）的中间，同时谱宽设置为δ 60，可以完整覆盖样品与内标的信号范围，所得谱图基线平整，适合进一步的核磁定量积分。

法维拉韦作为首个在此次疫情期间批准上市的抗病毒药物，引起了各界高度关注，关于其治疗COVID-19的临床试验已在全国多家中心启动。根据现有研究结果，法维拉韦对COVID-19有一定抗病毒疗效，将其临床适应证扩展至COVID-19值得期待，有待更大规模的临床试验验证。

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